间充质干细胞治疗牙周炎
牙周炎（periodontitis）主要是由局部因素引起的牙周支持组织的慢性炎症。发病年龄以35岁以后较为多见。如龈炎未能及时治疗，炎症可由牙龈向深层扩散到牙周膜、牙髓、牙槽骨和牙骨质而发展为牙周炎[1]。常由没有及时清洗的菌斑、残留食物、牙石等因素引起，糖尿病、全身性疾病及创伤可能为诱因[2]。
早期症状不明显，患者常只有继发性牙龈出血或口臭的表现，与龈炎症状相似。检查时可见龈缘、龈乳头和附着龈的肿胀、质松软，呈深红色或暗红色，探诊易出血。随着炎症的进一步扩散，出现.牙周袋形成；牙周溢脓；牙齿松动和脱落[2,3]。
如果没有及时治疗，牙周炎可以引起严重的全身性疾病，包括心血管疾病、呼吸道感染、癌症、糖尿病、神经退行性疾病和不良妊娠等[4,5]。
1.心血管疾病：在美国，心血管疾病被认为是死亡的主要原因，并且是导致残疾的主要原因。鉴于其较高的经济和社会影响，心血管疾病和牙周疾病之间的相关性已引起许多研究人员的关注。一项纳入5 项队列研究的Meta分析显示，牙周病患者发生冠心病的风险比对照组高1.14 倍。该研究表明，牙周炎患者的心血管疾病患病率和发病率均显著增加。一项利用感染Pg 的高脂血症小鼠进行的动脉粥样硬化动物模型研究表明，细菌感染与牙槽骨吸收和主动脉粥样硬化有关。Pg 和齿垢密螺旋体可诱导全身免疫反应，在口腔上皮、主动脉和全身器官中均发现细菌基因组DNA。此外，Pg 可通过Toll-4 样受体逃避非特异性免疫，从而促进血管中慢性炎症的发生。Pg 还可通过其分泌的外膜囊泡诱导人体样本中的血小板聚集，这可能是体内血栓形成的原因。牙周炎与高血压、动脉粥样硬化、中风密切相关[5].
2.糖尿病[8]：糖尿病是一种慢性代谢紊乱疾病，其特征是由于胰岛B 细胞产生胰岛素缺陷（1 型糖尿病）导致的高血糖症，或胰岛素敏感性降低（2 型糖尿病），或两者组合，可影响成人、青少年和儿童。值得注意的是，糖尿病和牙周炎呈现出“双向”联系，互相影响。牙周的慢性感染可导致全身炎症反应的失调，进一步引起代谢紊乱。事实上，患有急性感染（细菌和病毒）的个体会表现出严重且持久的胰岛素抵抗。一项针对124 名中年男性的研究证实了这一观点，即肠道病毒和肺炎衣原体的感染与胰岛素抵抗密切相关，这可能是由于这些感染会导致慢性的低度炎症。
在一项大鼠的糖尿病模型中，观察到Pg会导致牙龈血管功能降低和胰岛素抵抗增加。一项Meta 分析研究的结果表明，牙周治疗可以改善2 型糖尿病患者的血糖控制。相反，糖尿病也可能导致牙周疾病。事实上，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者患牙周炎的风险增加了3 倍[10]。
一项针对儿童和青少年1 型糖尿病患者的牙周检查发现牙龈炎患病率为21%，牙周炎患病率为6%；此外，针对1 型糖尿病的成年患者牙周查体发现受累的部位更多。总之，众多证据均已表明糖尿病和牙周病之间为双向关联，即糖尿病增加了罹患牙周炎的风险；相反，牙周炎症也会导致血糖控制不佳。牙周炎与肥胖发生发展有密切关系[11].
3.消化系统疾病：牙周炎和慢性胃炎、炎症性肠病（IBD）都是复杂的慢性疾病，其特征是异常的宿主免疫反应和失调的微生物群。新兴数据显示牙周炎与IBD之间存在关联，包括口腔炎症和肠炎之间的直接和间接机械联系。直接途径包括促炎微生物从口腔到肠道和免疫启动的易位。间接途径涉及全身免疫激活，可能对肠道产生非特异性作用。关于牙周疾病治疗对IBD病程的影响的数据有限，反之亦然，但早期的报道表明，牙周炎的治疗可降低全身免疫激活，而IBD的治疗与牙周炎愈合有关，强调了识别和治疗这两种情况的重要性[9]。
4.呼吸道感染：肺部感染可由细菌、真菌、病毒（包括COVID-9）和寄生虫引起。牙周病患者唾液中的牙菌斑病原体积聚，扩散到下呼吸道即可引起肺部感染。已被证实涉及肺部感染的口腔病原体包括放线杆菌、肺炎衣原体、具核梭杆菌、坏死梭杆菌及Pg 等。在小鼠感染模型中，Pg 可引起肺部持续性炎症反应，这一过程包括细菌聚集和促炎性细胞因子的产生。
一项对40 例接受气管插管的受试者进行的研究显示，无牙患者的口内也有大量放线聚集杆菌、Pg和福塞坦氏菌，这表明即使没有牙齿，口腔环境也为病原菌积累提供了有利条件。研究人员发现具核梭杆菌可引起一种从咽炎开始，最终导致Lemierre 综合征的呼吸道感染。肺炎衣原体作为呼吸道病原体，与哮喘、支气管炎和慢性阻塞性肺病有关。这种病原体也在口腔中存在，可通过口腔转移到下呼吸道，之后通过血液循环和单核细胞传播到脾、心脏和主动脉等其他部位[12]。
此外，肺炎衣原体感染与动脉粥样硬化的发展有关，这可能是口腔病原体导致动脉粥样硬化发生的另一机制。总之，上述研究表明口腔中存在的口腔或非口腔病原体均可导致呼吸系统疾病[12]。
5.阿尔茨海默病[13]:阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，其特征是记忆、思维、语言和学习能力的进行性和不可逆性损害，最终以死亡告终。如糖尿病一样，阿尔茨海默病和牙周炎也呈现双向关系。最近一项全面的口腔健康研究表明，脑损伤患者牙周炎患病率较高。事实上，炎症被视为牙周炎和阿尔茨海默病之间联系的关键点。阿尔茨海默病的标志是神经胶质细胞被激活并产生显著水平的炎性细胞因子。因此，在老年阿尔茨海默病和牙周炎患者中均检测到促炎细胞因子的增加。
一项观察不同抗炎药和细胞因子的研究强化了这样的假设，即炎症是阿尔茨海默病中神经变性的主要驱动因素，这表明非甾体类抗炎药（NSAIDs）可有效减缓阿尔茨海默病的发病。此外，宿主根据口腔细菌感染，机体会合成促炎细胞因子，提示牙周病可能导致阿尔茨海默病。从死后阿尔茨海默病人脑中可分离出来Pg 和齿垢密螺旋体的脂多糖，这表明来自这些病原体的毒力因子可能在脑炎症和阿尔茨海默病的发展中起作用。
此外，在死后的阿尔茨海默病患者脑中也检测到牙周病原体齿垢密螺旋体和肺炎衣原体等细菌，这表明除了炎症介质外，一些牙周病原体可能通过血液侵入大脑屏障。这在动物研究中已得到证实，该研究显示小鼠脑中存在Pg。虽然这些牙周病原体似乎与阿尔茨海默病的症状有关，但还需要进一步的纵向研究，将牙周病原体及其抗体与阿尔茨海默病的神经变性直接联系起来。总之，口腔卫生不良会导致慢性牙周炎，并可能间接增加阿尔茨海默病的风险。从这个意义上讲，保持良好的口腔健康很可能成为预防阿尔茨海默病的有效措施[14]。
6.不良妊娠:母亲感染与不良妊娠结局有关，包括早产、胎膜早破、先兆子痫、流产、胎儿宫内发育迟缓、低出生体质量、死产和新生儿败血症等[15]。由于孕妇的荷尔蒙变化，他们比非孕妇更容易患牙龈炎和牙周炎。临床上，大约40%的孕妇表现出牙周病。目前，已提出了两种不同的机制来解释牙周病如何与不良妊娠结局相关联：第一种假说提出口腔病原体可以从口腔移位并穿过胎盘，到达羊水内和胎儿循环；第二种假说则认为来自牙周病原体的内毒素或炎症介质系统性传播可能影响胎儿的发育或自然流产。
在牙周病期间产生的细菌病原体、抗原、内毒素和促炎细胞因子可以穿过胎盘屏障，导致身体内分泌的紊乱，这可能导致不良妊娠。具核梭杆菌是在各种胎盘和胎儿组织中发现的最常见的口腔病原体。一个足月死产的病例报告表明，呼吸道感染期间免疫反应减弱时，具核梭杆菌可以从母亲的口腔转移到子宫。此外，在子宫内感染中检测到具核梭杆菌和其他口腔亚种，可能来自相同的传染源。在早产患者的胎盘中也发现了其他口腔病原体，如Pg。Pg 的脂多糖还可诱导大鼠胎盘和胎儿生长受限和再吸收。虽然需要更多的研究来确定牙周病与不良妊娠结局之间存在因果关系，但迄今为止的研究结果表明牙周健康对于孕妇预防不良妊娠是必需的。
7.癌症：口腔癌一项包括3183 例受试者的Meta 分析研究显示，牙周病患者口腔癌的易感性增加。一项台湾研究调查了100 万个随机选择的保险病例，发现牙周炎患者患癌症风险高于牙龈炎患者，并发现Pg 通过诱导金属蛋白酶-9 的表达促进口腔鳞状细胞的侵袭和转移。在口服特异性化学致癌物的动物模型中证实了牙周病原体在口腔癌诱导中发挥着潜在作用，该研究表明牙周病原体Pg 和具核梭杆菌通过与口腔上皮细胞的直接作用刺激肿瘤的发生，并且该作用是由宿主非特异性免疫系统介导的。研究表明长期和重复接触Pg，通过上皮细胞间质转变样细胞的变化增加口腔癌细胞的侵袭性。因此，口腔病原体，特别是Pg 和具核梭杆菌已被证实与口腔癌的发展有关，表明它们可能是口腔癌早期阶段的生物标志物，可能是人类预防口腔癌的靶标[16].
结直肠癌是全球第四大导致死亡的癌症，有研究发现结直肠癌患者的肠道微生物群中存在大量具核梭杆菌。Warren 等在患有肿瘤的肠道中分离出口腔革兰阴性厌氧病原体，例如梭杆菌属、纤毛菌属和弯曲杆菌属。有研究证实口腔中具核梭杆菌可迁移到人肠道中并定殖，导致炎症的发生。此外，在肠道肿瘤小鼠模型中发现具核梭杆菌可增加肿瘤多样性并选择性地在肿瘤部位定殖，从而促进肿瘤的发展。在结直肠癌小鼠模型中证实了具核梭杆菌可以改变管腔微生物的组成，同时介导细胞因子的分泌并激活肿瘤发生的相关通路。以上这些数据表明具核梭杆菌通过促进炎症微环境，进而导致结肠直肠肿瘤的发展[17,18].
牙周炎与类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、免疫性肾炎、骨质疏松症，甚至精神疾病密切相关[19].
目前牙周炎的治疗局部抗炎和提高机体抵抗力，如保持口腔卫生，祛除牙石、菌斑、固定松动的牙齿。近年来间充质干细胞及干细胞外泌体治疗牙周炎发展迅速[6，20-23].
间充质干细胞
与胚胎干细胞相比，间充质干细胞（MSCs）在道德，伦理，法律和安全问题上较少，而且MSCs具有强大的自我复制更新能力，多向分化潜能和免疫调节功能。在1968年由Friedenstein首先在骨髓（BM-MSC）中发现和分离，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。随后在其它组织和器官发现和分离了MSCs，例如肺部，肌肉，肝，脂肪，神经，胎盘，脐带，羊膜，真皮等。2006年国际干细胞和基因治疗协会给MSCs制定标准，包括(1)MSCs在标准组织培养基上有塑料黏附性；(2)MSCs一定表达某种细胞表面标记物如CDl05，CD90，CD73．fIl是肯定不表达包括CIM5，CD34，CDl4或CDllb的标记物；(3)MSCs在体外环境能分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞系[24]。牙及周围组织也含有不同的MSCs，牙髓干细胞（DPSC），顶端乳头（SCAP），牙周韧带干细胞（PDLSC），牙龈衍生MSC（GMSC），牙卵泡干细胞（DFSC），牙胚干细胞（TGSC）和牙槽骨衍生的MSC（ABMSC）[20,25]，在维持牙及周围组织生长发育，抵抗疾病和保障牙齿及周围组织健康起重要作用[21]。
间充质干细胞治疗牙周炎的机理
1.牙周组织再生和修复：间充质干细胞的自我更新和多向分化能力，提示其具有分化并替代受损牙周组织的潜力。牙周膜是连接牙齿和牙槽骨的结缔组织，其中含有少量的PDLSC，在牙周组织受损时可修复牙周组织结构，重建牙周组织功能[22,23]。
2.旁分泌效应和干细胞外泌体：近年来，发现间充质干细胞在没有分化并直接修复组织缺损的情况下，仍有一定的治疗效果。值得注意的是，仅使用干细胞外泌体也能促进牙周组织的再生。研究表明：间充质干细胞能够分泌丰富的生物活性分子，如生长因子、趋化因子等，通过旁分泌效应，来调节损伤部位的微环境，从而抑制细胞凋亡和炎症、促进血管新生，最终促进组织修复。研究发现：牙源性间充质干细胞的免疫调节和抗炎作用能够帮助降低牙周炎患者牙周组织的活性氧自由基，从而缓解牙周炎症状[6,21]。
间充质干细胞治疗途径
间充质干细胞在组织再生治疗中通常包含细胞的分离、体外扩增和细胞的再植3个步骤。随着研究的进展，干细胞治疗的难点逐渐从间充质干细胞的分离和鉴定转移到间充质干细胞的使用方法。
1.MSCs悬液注射：MSCs悬液注射是指直接将细胞注入受损的牙周组织，这种方法简单且创伤小。将间充质干细胞注射在局部牙周缺损部位，在受损部位表现出炎症抑制和免疫调节作用，从而促进了新的牙周组织生成[26]。
2.MSCs细胞膜片技术：细胞膜片技术是一种组织培养方法，因其培养过程不使用酶解，使细胞间连接、细胞外基质蛋白等组织结构得以保留。Kwon等使用温度反应性培养基成功将细胞连同其细胞外基质成片地剥离下来，并通过像三明治一样数层细胞堆叠起来，以构建出立体的组织。磁化控制法、电化学控制法等方法随后也被成功运用于细胞膜片的获取。使用这种技术可以将间充质细胞在不使用支架的情况下移植入受损部位，相比传统支架，细胞膜片植入产生的炎症反应更轻，细胞丢失更少。相较于细胞悬液注射，细胞膜片技术移植的细胞能够依靠细胞外基质贴附在移植部位，细胞间相互连接，能够存留更长的时间，有更高的细胞存活率。同时，与细胞悬液相比，细胞膜片中的矿化相关基因（碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白等） 和牙周组织特异性基因（Ⅲ型胶原蛋白、骨膜素）表达显著上调，PDLSC细胞膜片中也高表达碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白等基因。有报道细胞膜片治疗3名牙周炎患者，8周后患者牙周组织得到改善，细胞膜片周围可见类牙骨质和类牙周膜组织形成。另一研究，利用脐带间充质干细胞治疗10名患者6个月后探诊深度、临床附着水平、影像学骨高度都得到了明显改善，进一步证实了细胞膜片长期治疗中的安全性和有效性[26,27]。
3.生物支架材料：支架材料可以通过改善干细胞移植效果、提高细胞移植部位的稳定性以及控制细胞的输送将间充质干细胞的疗效最大化。除了降低移植细胞被冲刷掉的概率，使用材料作为载体还能够引入额外的生物活性分子，如血管内皮生长因子等，用来促进间充质干细胞在移植部位的生长和分化[26]。
随着组织工程的发展，牙周再生中的生物材料已经开始从简单的固定细胞和缓释活性分子的单相支架材料，逐步地开始模拟牙周的牙骨质-牙周膜-牙槽骨的复合结构。Iwata等用3层细胞膜片贴在牙齿根面后用可降解的聚乙醇酸网架支撑，最后多孔的β-磷酸钙填补骨缺损，6周后受损部位形成新的骨、牙骨质和穿插其中的胶原纤维，实现了牙周完整的恢复[27]。
间充质干细胞治疗牙周炎临床研究
在Meta分析中，15研究369病例，脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞等，观察临床6，12个月，结果显示，临床粘附水平（CAL）、探测深度（PD）、牙龈萎缩（GR）、X-牙槽厚度增加、骨髓骨密度等明显改善。无副作用[28]。另一组分析包括123例牙周炎和158例牙周缺陷。只有两项具有小型随机对照试验被纳入荟萃分析，共有59名患者和70个牙周缺陷。在三个月时，CAL，PD和GR有改善[29]。
间充质干细胞治疗牙周炎正在进行大量临床 研究，结果显示令人满意，应用前景广阔。
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作者：程保合
济南至晟生物科技有限公司
